‘火狐体育买球’QuEChERS方法结合高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤中20种抗生素

来源：《农业环境科学学报》2017 年 08 期作者：孟明辉，贺泽英，徐亚平，王璐，彭祎，刘潇威*单位：农业部环境保护科研监测所section 38= wx_fmt=png) padding:= border-width:=为创建一种基于QuEChERS（较慢Quick、非常简单Easy、廉价Cheap、高效Effective、轻巧Rugged、安全性Safe）同时测量土壤中20 种抗生素多残余的分析方法，土样经提取液（EDTA，乙腈∶磷酸盐）萃取、集中固相提取材料（PSA，C18）净化后，使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）展开测量。通过试验优化了有所不同萃取方法、净化吸附剂比。

结果表明：该方法在7 个加到水平（2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·kg-1）下具备较好的回收率，回收率范围为61.4%~118.9%，比较标准偏差大于20%（n=5）；绝大多数抗生素的方法定量限为2.0~5.0 μg·kg-1，R2小于0.990。该方法可应用于农业土壤样品的检测。

前言抗生素被普遍用作大批量养殖产业，能维护动物免遭疾病，但它也可以通过动物消化以有机肥形式转入到环境土壤和周围的水体中。在近四五十年中，这些药物的使用量大大减少，造成了根本性的环境问题，因而倍受注目。近年来，抗生素早已被指出是一种新型的潜在污染物。

尽管在土壤环境基质中已找到了多种抗生素药物，但仍仍未土壤中抗生素多残余的标准分析方法。由于土壤基质的复杂性，很难从土壤中萃取抗生素。为了评价抗生素的环境影响，必须创建一种可信、精确的检测土壤环境中抗生素的方法。

传统环境样品中抗生素的萃取方法是基于用于乙腈-磷酸盐成像萃取，融合固相提取（SPE）净化。Blackwell 等利用超声波辅助法萃取，固相提取净化土壤和猪粪中的兽药抗生素，马丽丽等创建超强高效液相色谱/串联质谱法同时测量土壤中18 种抗生素，这两种方法具备较好的回收率、较低的定量缩，然而超声波萃取和多次重复萃取较为耗时。

在有数的净化方法中，固相提取因其较好的净化效果和较高的回收率被普遍应用于土壤、粪便、牛奶和动物的组织等基质中。虽然固相提取具备很多优点，但是其步骤繁复、耗时，并且材料便宜。2003 年Anastassiades 等创建了一种较慢、非常简单、廉价、高效、安全性的方法，即QuEChERS 方法，最初是用作蔬果类农药残余的萃取、净化，近年来，它也被用作抗生素的多残余分析中。

这种方法使用乙腈萃取，经集中固相提取材料（d-SPE），如PSA（Primary Secondary Amine）、C18（ Octadecylsilane）、GCB（Grafted Carbon Black）的净化，然后上机。该方法的优点是具备非常简单的前处置步骤、低的回收率、精确的测量结果，并且大幅度减少了材料和试剂的成本以及实验人员认识危害溶剂的可能性。Bourdat-Deschamps 等创建了环境水样中抗生素的QuEChERS 方法，回收率一般在75.0%以上。Dorival-García 等创建了QuEChERS 方法用作检测肥料中17 种抗生素，回收率范围为95.3%~106.2%，比较标准偏差大于7.0%。

但是，在土壤基质中抗生素多残余的QuEChERS 分析方法仍未闻报导。本研究的目的是创建一种检测土壤基质中20 种抗生素的QuEChERS 方法。研究内容还包括：色谱条件、萃取步骤、净化步骤的优化，并通过回收率、线性、定量缩、基质效应、实际样品的检测检验所创建方法的可行性。

1 材料和方法1.1标准溶液的提炼标准品：磺胺醋酰（Sulfacetamide，SAA），磺胺二甲异嘧啶（Sulfisomidine，SIM），磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ），磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ），磺胺砒啶（Sulfapyridine，SPD），磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SMR），磺胺对甲氧嘧啶（Sulfameter，SME），磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SDD），磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole，SMT），磺胺邻二甲氧嘧啶（Sulfadoxin，SDX），磺胺乙噁唑（Sulfamethoxazole，SMZ），磺胺噁唑（Sulfamoxole，SMX），磺胺间甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM），磺胺二甲异噁唑（Sulfisoxazole，SIX），磺胺苯酰（Sulfabenzamide，SBA），磺胺喹恶啉（Sulfaquinoxaline，SQX），磺胺间二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM），红霉素（Erythromycin，ERY），罗红霉素（Roxithromycin，ROX），克拉霉素（Clarithromycin，CLR），标准品纯度皆小于98.0%，购于德国DrEhrenstorfer 公司。上述标准品皆用于甲醇提炼成1000 mg·L-1 标准储备液，-20 ℃储存。用甲醇提炼上述20 种抗生素的混合标准溶液，浓度为1 mg·kg-1，-20 ℃储存。1.2材料与试剂甲醇和乙腈（色谱显，Fisher 公司），甲酸（98.0%，Acros Organics 公司），Na2EDTA·2H2O（分析显，国药有限公司）；磷酸，氯化钠（天津化学试剂公司）。

实验用水皆经Milli-Q 净水系统净化。集中固相提取材料（PSA、C18、GCB）购于Agilent 公司，HLB 固相提取小柱（500 mg，6 mL）购于Waters 公司。

磷酸盐缓冲液（27.2 g KH2PO4 与1.3 mL H3PO4 用超纯水定容至1L）。1.3仪 器涡旋振荡器（美国Thermo 公司）；高速冷藏离心机（香港Heal Force 公司）；N-EVAP 氮刮起仪（美国Organomation 公司）；Acquity 高效液相色谱仪，C18 色谱柱（1.8 μm；2.1 mm × 100 mm,美国Waters 公司）；Qtrap 4500 三重四级杆质谱仪（美国SCIEX 公司）。1.4色谱条件液相条件：柱温40 ℃，流动相为乙腈（A）、0.1%甲酸（B），流速0.3 mL·min-1；流动互为梯度为0~1.5 min10%A，1.5~8 min 10%~70%A，8~8.1 min 70%~10%A，8.1~10 min 10%A。质谱条件：离子喷雾电压4.5 kV；离子源温度500 ℃；离子源气体1（GS1）50 psi（1 psi=6.89 kPa）；离子源气体2（GS2）50 psi；使用正离子检测模式。

目标抗生素的保有时间、离子对、去簇电压、撞击能等质谱条件闻表格1。1.5土壤样品的制取土样采自天津市西青区农田0 ~ 20 cm 的表层土壤（经检测未含目标抗生素），在直径2.0 m 左右的范围内采样大约10.0 kg，大自然风干后过2.0 mm 孔径滤。土壤pH 7.2，有机质含量1.5%。1.6萃取和净化步骤QuEChERS 方法步骤：称取5.0 g 土样于50 mL离心管中，重新加入一定量标准物质，静置一段时间，然后重新加入0.4 g Na2EDTA、10.0 mL 缓冲液和10.0 mL 乙腈，轻微摇晃3 min，再行重新加入2.0 g NaCl 之后手摇1 min，8000 r·min-1 离心5 min；汲取2.0 mL 上清液于5.0mL 所含集中固相提取材料（25.0 mg PSA、10.0 mgC18、100.0 mg MgSO4）的离心管中，涡旋1 min，5000 r·min-1 离心3 min，汲取1.0 mL 上清液于玻璃离心管中，在35 ℃水浴中氮刮起至将近腊，1.0 mL 甲醇∶水（体积比1∶1）复溶，过0.22 μm 纤维滤膜，LC-MS/MS 上机。

方法优化时，每组外加两个仅有程序空白平行样（上机之前重新加入一定量的标准物质溶液），以校正各待测化合物在土壤基质中不存在的不能忽视的基质效应。SPE 方法步骤：称取5.0 g 土壤样品于50 mL 离心管中，重新加入0.4 g Na2EDTA、10.0 mL 缓冲液和10.0mL 乙腈，手摇3 min，8000 r·min-1 离心5 min，将上清液全部放入球形瓶，然后复蒸至10.0 mL 以下，再行用超纯水溶解至100 mL，用甲酸调节pH 至2.5，开始过HLB 小柱，过柱前，预先用6.0 mL 甲醇、6.0 mL 超纯水活化SPE 小柱。过柱后，用6.0 mL 甲醇洗刷HLB柱，将洗脱液氮刮起至将近腊，后同QuEChERS 方法。

2 结果与辩论2.1萃取条件的优化使用成像辅助萃取可提升目标物的回收率，本试验对该方法的效果展开了检验。按文1.6 中QuEChERS 方法步骤展开试验，结果（图1）指出成像对目标抗生素的萃取完全没影响。因此，本试验不使用成像辅助萃取，进而节约前处置时间。

2.2净化条件的优化萃取已完成后，为增加基质效应，将所含目标抗生素的有机互为重新加入到d-SPE 净化材料（PSA、C18、GCB）中展开下一步净化。PSA 作为很弱阴离子互相交换剂，可以构成强劲相互作用的氢键，并除去脂肪酸和其他极性有机酸；非极性吸附剂C18 反互为导电脂肪和一些矿物质；GCB 保有平面物质，用作除去色素。氯气硫酸镁作为传统干燥剂用作除去有机溶剂残余的水。

如图2 右图，在加到浓度为100.0 μg·kg-1 水平下，搭配5.0 mg GCB、100.0 mg MgSO4 作为净化材料获得较低的回收率。其中，GCB 对磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺噁唑、磺胺二甲异噁唑、磺胺间二甲氧嘧啶有少量导电，回收率大约60.0%，尤其是对红霉素具备反感的吸附作用，回收率为0.6%。

因此，本试验没自由选择GCB，而是搭配PSA 和C18 作为净化材料。本试验对这两种净化材料分别设计了3 个水平：C18（ 10.0、25.0、50.0 mg），PSA（10.0、25.0、50.0 mg）。为优化到其最佳用料，回收率和基质效应必需同时考虑到。基质效应（MatrixEffects，ME）计算公式如下：ME（%）=（Sm/Ss-1）×100 （1）式中：Sm 和Ss 分别回应基质标曲和溶剂标曲的斜率。

当ME 为-20.0%~20.0%、-50.0%~-20.0%和20.0%~50.0%、-50.0%和50.0%时，分别回应严重、中等、较强的基质效应。如图3 至图6 右图，当自由选择50.0 mg PSA 作为净化材料时，磺胺醋酰、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺噁唑的回收率高于55.0%。对于C18，三组基质效应皆高于60.0%，大多数高于40.0%，但用于10.0 mg C18 时的回收率皆小于65.0%。所以，本试验最后自由选择25.0 mg PSA、10.0 mg C18 作为净化材料。

图7 为最后优化后的基质效应。2.3与SPE 方法的较为本研究将QuEChERS 方法和传统SPE 方法展开了回收率对比，实验结果如图8 右图。

对于绝大多数抗生素而言，QuEChERS 方法的回收率小于SPE 方法，特别是在是磺胺二甲异恶唑和红霉素。实际试验过程对比指出，QuEChERS 方法非常简单的前处置步骤仅有耗时1 h，较SPE 方法5 h 深感延长；QuEChERS 方法单个样品比SPE 方法节省大约70 元（主要节省了Waters Oasis HLB 小柱）；QuEChERS 方法整个流程的试剂基本正处于堵塞状态，相当大程度上减少了实验人员认识危害溶剂的可能性。试验证明，对于本试验所指定的目标抗生素，QuEChERS 方法高于SPE 方法。

2.4方法检验本试验通过线性、回收率和定量缩对QuEChERS方法展开了检验。由空白基质提炼的8 个浓度水平（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·kg-1）的标准工作曲线呈现出较好的线性，R2 在0.990~0.998 之间（表格2）。在7 个加到浓度水平（2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μg·kg-1）下获得的回收率为61.4%~118.9%，比较标准偏差高于20.0%。该方法的定量缩给定为具备可拒绝接受的回收率（60.0%~120.0%）和比较标准偏差（大于20.0%）时的低于浓度。

本试验所挑选的目标抗生素的定量缩大部分都高于5.0 μg·kg-1，比Peysson 等所报导的值低。在10.0、50.0、200.0 μg·kg-1 加到浓度下的回收率、比较标准偏差、定量限见表格3。

2.5实际样品检测在天津市东丽区菜地共计收集10 个土样：Q-1 茄子地，Q-2 甘蓝地，Q-3 菠菜地，Q-4 红薯地，Q-5 花上菜地，Q-6 大白菜地，Q-7 污灌区，Z-1、C-1、F-1 为玉米地。每个样品大约500 g，大自然风干后过2.0 mm 孔径滤，随后用本研究创建的QuEChERS 方法展开检测，其中8 个土样有检测，大部分检测抗生素高于定量缩，Q-2 中罗红霉素浓度低于定量缩，浓度为3.7 μg·kg-1，Q-1 和Q-5 中克拉霉素浓度低于定量缩，浓度分别为2.9、2.4 μg·kg-1。

罗红霉素和克拉霉素这两种大环内酯类抗生素在土壤中水解较快，吸附性较强，可较长时间平稳地残余在土壤基质中。上述结果表明，本方法可应用于土壤中抗生素含量的检测。

3 结论（1）通过对萃取方式、净化材料用量及用料的优化，并展开方法的检验，创建了基于QuEChERS 方法同时检测土壤中20 种抗生素多残余的高效液相色谱-串联质谱法。（2）对于所指定的目标抗生素，QuEChERS 方法高于SPE 方法，反映了较慢、非常简单、廉价等特点。

（3）QuEChERS 方法现顺利应用于土壤中多种抗生素含量的检测，可为环境风险评估获取一定的数据反对。

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